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以下是关于C18反相柱使用细节的详细解析，涵盖选型、操作、维护及常见问题处理，旨在优化分离效果并延长柱子寿命：
一、使用前准备
1. 柱子筛选与活化
- 填料参数匹配：根据样品性质选择合适填料，如硅胶基质(ODS)适用于常规分离，但需避免强酸强碱(pH 2-7.5)；聚合物基质耐碱但不耐高温，适合碱性样品。
- 粒径与孔径：小粒径(如5μm)适合高效分离，大孔径(如300Å)适用于大分子(如蛋白质)。
- 活化操作：使用或存放后，用有机溶剂(乙腈或甲醇)低流速冲洗10个柱体积(CV)，使C18链充分伸展，避免“水相塌陷”导致的保留能力下降。
2. 流动相平衡
- 更换流动相后，需用目标流动相冲洗10-20 CV至基线平稳，确保柱子达到热力学平衡。若从纯有机相过渡到含水相，建议初始有机相比例≥5%，再逐步调整。
二、流动相选择与优化
1. 溶剂体系
- 经典组合：水-甲醇或水-乙腈，乙腈洗脱能力更强，适合中等极性样品；甲醇对极性化合物保留更佳。
- 避免纯水相：纯水会导致C18链蜷缩，降低柱效，需至少含5%有机溶剂。
- 缓冲盐与pH：
- 调节pH可改善酸碱性化合物的分离(酸性样品pH<7增加保留，碱性样品pH≥7增强选择性)；
- 优先选用易挥发的铵盐缓冲液，避免难溶盐析出堵塞柱子。
2. 梯度洗脱设计
- 采用线性梯度或阶梯梯度，避免剧烈浓度变化冲击柱子。
- 梯度结束后需用高有机相冲洗柱子，防止杂质残留。
三、样品处理与进样
1. 前处理要求
- 过滤：样品需经0.22 μm滤膜过滤，去除颗粒物。
- 溶剂兼容性：样品溶解溶剂需与流动相兼容，避免沉淀(如极性样品用甲醇/乙腈溶解，疏水样品可用少量水稀释)。
2. 进样控制
- 体积限制：进样量通常为10-100 μL，过载可能导致峰形展宽或分离度下降。
- 浓度适配：高浓度样品需稀释，防止柱超载或污染。
四、操作参数设置
1. 流速与柱压
- 常规流速为1-2 mL/min(5μm粒径柱)，高压可能压缩填料导致柱效下降。
- 若柱压骤升，需检查是否堵塞或污染，及时冲洗或反冲。
2. 柱温控制
- 室内即可满足多数需求，但对热敏感样品可降温(如4℃)，复杂分离可适当升温(≤40℃)加速传质。
五、维护与保存
1. 日常维护
- 冲洗：每次使用后用纯有机溶剂(乙腈或甲醇)冲洗10 CV以上，去除残留样品。
- 封端保护：硅胶基质柱需避免长时间接触水或强酸强碱，定期用乙腈保存。
2. 长期存储
- 保存于纯有机溶剂(如乙腈)中，密封避光，禁止吹干或暴露于空气(防微生物滋生或填料脱水)。
3. 再生处理
- 若柱效下降，可用高浓度有机溶剂(如100%乙腈)冲洗10 CV以上，或按厂商建议进行化学再生。
六、常见问题与解决方案
1. 峰形异常
- 拖尾：流动相pH不当或硅羟基未封端，可添加三乙胺或调整pH。
- 前伸峰：酸性样品在低pH下保留不足，需降低pH或增加有机相比例。
2. 分离度差
- 优化梯度程序，检查流动相比例或更换封端完善的柱子。
3. 柱寿命缩短
- 避免强酸强碱、纯水相及未过滤样品；定期维护防止污染积累。
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