细胞攻略 | MFC(小鼠胃癌细胞)培养教程

Tips：

1. 细胞收货出现漏液、培养瓶破损、干冰完Q挥发等异常情况时，及时拍照联系销售人员。

2. 若细胞出现漂浮，可以先收集瓶内细胞悬液，离心收集细胞，用胰酶消化后重新接种到新的培养瓶内，由于发货会出现漂浮的细胞贴壁本身较弱，建议使用高贴附培养瓶或提前包被过的培养瓶培养细胞。

3. 尚恩生物T25瓶发货的细胞内含对应细胞的完Q培养基，可以收集原装培养瓶内培养基经1500rpm离心5min后，取上清于4℃保存用于后续细胞培养。

Tips：

1. 对于消化细胞程度，客户如果经验不多，无法准确掌控胰酶作用时间，建议客户按照下述操作：胰酶首先复温到室温后加入细胞，放入37度培养箱，然后每隔30秒，即吹打下细胞（此时吹打细胞应尽量轻柔，不能强行将细胞吹下，否则细胞可能出现机械损伤），如果能够吹打散细胞，说明细胞消化完成可以终止消化，如果30秒吹打不下，再等30秒重复操作直至能够轻柔的吹下细胞。

2. T25瓶加10-12ml完Q培养基，10cm皿加12-15ml，2-3天换液一次。

3. 细胞收货后首C传代建议按1：2传代，后续培养可以视具体细胞生长状态和密度情况决定传代比例。

Tips：

1. 检测冻存细胞活性结果未合格前，培养瓶内细胞建议继续培养直至确认冻存合格方可视需要丢弃；

2. 程序性冻存液需要配合程序性冻存盒使用，若使用非程序冻存液可以按产品说明书处理降温过程；

3. T25培养瓶长满通常可以冻存2-3管，10cm皿长满可以冻存3-4管；

Tips：

1. 冻存管在液氮长期保存过程中难免渗入液氮，取出细胞时震动不要过大，水浴前一定要观察管内是否存在液氮，若有液氮建议静置一会待液氮完Q蒸发后再水浴；

2. 水浴时可以使用一次性PE手套包住冻存管避免直接接触水源，可以降低管盖缝隙渗入水导致污染的概率；

3. 水浴至剩米粒大小时及时终止水浴，避免过度水浴或水浴时间不足；

4. 建议水浴完成后直接在离心管内离心细胞，避免再次转移细胞；

5. 复苏后的细胞比较脆弱，吹打和转移细胞时尽量轻柔；

细胞密度怎么计算的？

严格意义上，细胞密度需要收集细胞悬液计数细胞数量，但在实际培养过程中，并不需要为了精确控制细胞数量而消化细胞计数。因此，常用的细胞密度指细胞相对于最大生长密度的比值，贴壁细胞可以粗略的用细胞所占培养容器底面积百分比表示，即显微镜下观察培养容器底部，有细胞的区域占总区域的百分比值，当然这种表达方式受限于单个细胞生长不同密度时所占面积不同导致并不严谨，但也是相当直观、简便的表现细胞状态的一种方式；

NO.2培养过程中细胞碎片较多怎么处理？

1. 细胞内的黑色颗粒是细胞外分泌泡及细胞器折光，这个属于细胞自身特性，无法清除也无法改变，大部分细胞都会有这种现象，只是不同细胞颗粒多少有区别，细胞培养体系不适应、营养缺乏、渗透压异常等均可能导致细胞内颗粒增加，建议使用合适的培养条件。

2. 细胞外的黑色颗粒大部分是细胞碎片和细胞代谢产物，可以先吸走培养基后用PBS润洗清除，再加新的培养基继续培养。润洗不能清除的可以换液清洗后等细胞密度70-80%左右消化处理细胞，消化完成后加完Q培养基终止消化，混匀细胞，收集细胞悬液900-1000rpm(约150g)离心3min，弃上清。再加5ml PBS重悬细胞，再离心后，用完Q培养基重悬接种到新的培养皿。第二次PBS重悬是为了去除碎片，如果平时碎片比较少，传代时可以省略PBS重悬的步骤；如果碎片很多，建议PBS多洗几次。

NO.3细胞具体消化时间是多久？

每个客户用的胰酶活力及消化步骤、试剂都是不一样的，不能完Q规定消化时间，以实际消化效果和客户经验为准。