IPS诱导肝类器官培养攻略

一、实验准备

1、hPSC诱导分化肝类器官试剂盒（abs90127-1kit）

产品组成：

2、辅助试剂

3、实验耗材

 二、诱导流程图

三、培养方法

1、hPSC 分化为内胚层细胞（DE）（以6孔板2个孔为例）

（1）取5.938mL 基础培养基1+60μL 补充剂A+2μL 补充剂B 配成DE 分化培养基①，可同时培养6 孔板的3个孔；
（2）基质胶在4℃下解冻，与DMEM/F12 均匀混合，铺板，备用。
（3）当hiPSC 的汇合度达到75%-85%，吸去培养基，用2mL 1x 室温PBS（不含Ca²⁺/Mg²⁺)清洗hiPSC，吸去PBS。
（4）加入1mL 的室温hESC/iPSC Passage Solution（人多能干细胞消化液），转移到37℃ 5% CO₂细胞培养箱中5 min，使其解离成单细胞。
（5）5 min 后，吸去hESC/iPSC Passage Solution（人多能干细胞消化液），加入等体积的Advance 人多能干细胞培养基，并使用P-1000 吸头轻轻上下吹打细胞，制成单细胞悬液，使用自动细胞计数器计数细胞，使用台盼蓝排除死亡细胞。将细胞单悬液收集到15mL 离心管中，室温下300g 离心5 min。
（5）从基质胶包被的板中小心地抽吸包被液而不损坏基质胶涂层表面。
（6）离心结束，充分去除上清，用1mL DE 分化培养基①重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。
（7）将细胞悬液以2.0 x10⁵个细胞/mL的浓度转移到包被的孔中，加入1mL DE 分化培养基①，使孔中的体积达到2mL；
（8）24h 后（第1 天），13.86 mL 基础培养基1+140μL 补充剂A 配成DE 分化培养基②，可同时培养6 孔板的2个孔，吸去培养基，并加入2mL DE 分化培养基②，连续培养2 天，每24小时换一次液。
（9）第3 天换HS 培养基前可取一孔进行内胚层指标检测。

2、DE 诱导分化为肝特化谱系细胞(HS)（以6 孔板2 个孔为例）

（1）第3 天，将19.9 mL 基础培养基2 与100μL 补充剂C 充分混合，配制成HS 培养基，可同时培养6 孔板的2个孔，从培养物中抽吸培养基，在6 孔板中每孔用2 mL1x 室温PBS（不含Ca²⁺/Mg²⁺)清洗培养物，然后从孔中移除PBS，每孔加入2 mL HS 培养基。
（2）将培养板放入37℃ 5%CO₂ 培养箱中培养，每24h 更换一次培养基，连续培养5 天。
（3） 第8 天埋胶前可取一孔进行HS 指标检测。

3、HS 诱导分化为3D 肝类器官（以24 孔板6 个孔为例）

（1）第8 天，将194.1mL 基础培养基3+5.9mL 补充剂充分混合，配制成3D 肝类器官培养基，分装保存。
（2）在冰上解冻基质胶，并将移液器吸头提前置于-20℃冰箱中。
（3）吸出HS 培养基，用2mL1x 室温PBS（不含Ca²⁺/Mg²⁺)洗涤1 次。
（4）加入含10μM Y-27632 的室温hESC/iPSC Passage Solution（人多能干细胞消化液） 并在37℃、5% CO₂ 培养箱中孵育5 min；5 min 后吸去hESC/iPSC Passage Solution（人多能干细胞消化液），每孔加入1mL 恢复室温的DMEM/F12（含10μM Y-27632），轻轻吹打细胞，使细胞脱离孔底。
（5）使用自动细胞计数器计数细胞，使用台盼蓝排除死亡细胞。
（6）将细胞悬液收集到15 mL 离心管中，室温下300 g 离心5 min，吸出培养基并将细胞重悬于冷基质胶中，以3000-10000 个细胞/孔的密度包埋在30-50μL 基质胶中，将基质胶与细胞一起置于冰上。
（7）将200μL 基质胶/细胞混合物按每孔30μL 接种到24 孔板中。
（8）将板置于37℃、5%CO₂ 培养箱中20-30 分钟使基质胶凝固。
（9）每孔加入700μL 3D 肝类器官培养基进行长期培养，每隔一天更换培养基，7-10 天传代。

4、3D 肝类器官传代

（1）取出冷冻的基质胶置于4℃解冻，并提前将枪头放置在-20℃预冷1h；
（2）吸除培养基，加入1mL 预冷的PBS 溶解基质胶，将混合液转移到1.5mL EP 管中，300g离心5min，去除上层的PBS 和基质胶；
（3）加入1mL 类器官传代消化液，吹打5-8 次，使类器官与类器官传代消化液充分接触，接着转移到培养箱中，静置解离5min；
（4）5min 后取出EP 管，300g 离心5min，去除上清，再加入1ml DMEM/F12，吹打孔中混合物40-50 次，使类器官团彻di解离成单细胞，离心，去上清；
（5）用预冷枪头按每孔30μL 的量在离心管中加入适量的基质胶，吹打5-8 次，均匀混合单细胞-基质胶，注意吹打过程中避免产生气泡；
（6）将提前放在培养箱中的24 孔板取出，在孔中心位置加入30μL 胶滴，缓慢打入混合液时，逐渐向上移动枪头，使细胞均匀分布在胶中；
（7）将培养板放在培养箱中，20-30min，使胶滴凝固；
（8）小心沿孔壁加入700μL 恢复室温的3D 肝类器官培养基，注意不要碰到胶滴；
（9）将孔板放到培养箱中，继续培养，每隔1 天换液一次（可周一、周三、周五换液，周五可添加至800μL，周六、周日不换液），1 周左右传代一次。

（10）肝类器官成熟后可进行染色鉴定或肝祖细胞/肝干细胞检测。