唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的培养条件与保存方法及注意事项！

唐菖蒲伯克霍尔德氏菌是Burkholderia属的微生物，原产地为中国。菌落浅黄色，圆形，表面光滑、湿润、稍凸起，边缘整齐。菌体呈短杆状，单个或成对排列，革兰氏阴性。主要用途为研究。

一、菌种简介

平台编号：Bio-132196

规格：冻干物

拉丁属名：Burkholderia Gladioli

中文名称：唐菖蒲伯克霍尔德氏菌

拉丁名称：Burkholderia gladioli

模式菌株：否

其它保藏中心编号：=CMCC（B）10802

来源历史：←中国食品药品检定研究院

收藏时间：2021/8/5

特征特性：菌体短杆，单个或成对排列，革兰氏阴性。

参考用途：GB 4789.28培养基质控用标准菌株。

生物危害程度：三类

致病对象：无

分离基物：食品

培养基编号：CM0002

培养基名称：营养肉汁琼脂

培养基成分：蛋白胨 5.0g，牛肉浸取物 3.0g，NaCl 5.0g，琼脂 15.0g，蒸馏水 1.0L，pH7.0。[注] 培养芽孢杆菌时加入5mg MnSO4·H2O，则有利于产生芽孢。推荐使用商品化成品培养基。

培养温度：36 ~36 ℃

培养时间：24-48 小时

需氧类型：好氧

用途：GB 4789.28培养基质控用标准菌株。

注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准）

二、培养基

*营养琼脂培养基（NA）

*LB 培养基（以上培养基选一即可）

三、保藏条件

安瓿瓶冻干菌种和培养物应在 2-8°C 保存。西林瓶菌种请置于-20℃冷冻。甘油保藏温度为-80°C;请勿长期置于室温。

四、保存方法

1、传代保存法：培养基的浓度不宜过高,营养成分不宜过于丰富,尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。培养温度通常以稍低于生长温度为好。若为产酸菌种,则应在培养基中添加少量碳酸钙。

2、液体石蜡覆盖保存法：该法较前一种方法保存菌种的时间更长,适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。

3、悬液保存法：

①蒸馏水保存法：适用于霉菌、酵母菌及绝大部分放线菌,将其菌体悬浮于蒸馏水中即可在室温下保存数年。本法应注意避免水分的蒸发。

②糖液保存法：适用于酵母菌,如将其菌体悬浮于10%的蔗糖溶液中,然后于冷暗处保存,可长达10年。除此之外,也可使用缓冲液或食盐水等进行保存。

4、载体保存法：①土壤保存法;②砂土保存法;③硅胶保存法;④磁珠保存法;⑤麸皮保存法;⑥纸片(滤纸)保存法。

5、常用的冷冻保存法：

①低温冰箱保存法(-20℃、-50℃或-85℃)：低温冷冻保存时使用螺旋口试管较为方便,也可在棉塞试管外包裹塑料薄膜。保存时菌液加量不宜过多,有些可添加保护剂。此外,也可用φ5mm的玻璃珠来吸附菌液,然后把玻璃珠置于塑料容器内,再放入低温冰箱内进行保存的。

②干冰保存法(-70℃左右)：即将菌种管插入干冰内,再置于冰箱内进行冷冻保存。

③液氮保存法(-196℃)：是适用范围的微生物保存法。

五、微生物培养方法

1、平板划线分离法:把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环圈在平板培养基表面,通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞,经培养后生长繁殖成单菌落。

2、稀释涂布平板法将菌液进行一系列的梯度稀释,然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养,在稀释度足够高的菌液里,聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞,从而能在培养基表面形成单个菌落。

上述两种方法虽然都可以实现观察菌落特征的目的,但平板划线分离法不能对菌落计数,而稀释涂布平板法培养过程复杂,对平板的要求比较高,可参照以下步骤:

a、制备平板培养基将氯化钠蔗糖琼脂培养基加热溶化并冷却至65℃,向氯化钠蔗糖琼脂培养基中加入克林霉素溶液3~5ml并混合均匀,然后取20ml混合均匀的培养基溶液倒入培养皿,轻轻摇动培养皿,使培养基溶液均匀分布在培养皿底部,待培养基溶液凝固后即得平板培养基。

b、制备活性污泥混合液称取活性污泥土样15g,放入盛100ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中,振摇15~20min混合均匀,用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀,制成活性污泥混合液。

c、培养基涂布从活性污泥混合液中吸取0.2ml,滴在平板培养基表面的位置,用无菌玻璃涂棒将活性污泥混合液沿同心圆方向轻轻地向外扩展,使之分布均匀。

六、注意事项

1）冻干活化，干粉要全部用完，不能预留，用无菌吸管吸取 0.3ml-0.5ml 的培养液（即以上建议的培养基配方，不加琼脂）或者无菌水，滴入冻干管中，轻轻振荡至其溶解。吸取全部菌悬液，接种在培养基上（建议不超过 2 支平板或者斜面，若接种液体培养基，则试管液体不超过 5ml 为宜）；

2）经过冷冻干燥保藏，菌种处于休眠状态，复苏培养时可能会延迟生长，这时需较长的培养时间； 若您收到的是已复苏的培养物（非冻干菌），则可以直接用于您的实验，或根据需要转接培养如有不明白之处，请务必先咨询我单位技术人员，避免不必要的损失；

3）微生物菌种应保藏于低温、清洁干燥的地方，室温放置时间过长会导致菌种衰退；

4）菌种操作应在无菌条件下进行；转种完毕，应经灭菌再做丢弃处理；

5）应根据菌种状况及时转接，冻干菌种保藏时间通常为 2-25 年；

6）菌种使用过程中如出现杂菌污染或菌种生产性能下降，应及时和微生物菌种查询网联系。

7）如若有菌种复苏不活或者污染等情况，请在收到菌钟后 2 个月内联系，逾期不予受理；

8）打管操作需由专业微生物技术人员在相应的防护设备中进行，生物危害程度为三类的菌种应在生物安全柜中操作，打管时冻干管应远离面部，保护眼睛。

9）安瓿瓶开封：用浸过 75％酒精的脱脂棉擦净安瓿管，用火焰加热其顶端，滴少量（2-3滴）无菌水至加热顶端使之破裂，用锉刀或者镊子敲下已破裂的安瓿管顶端并将冻干管开口处在火焰上过一遍，并保持在火焰旁操作。

10）甘油管使用：使用本甘油菌时可以不用融解，在甘油菌表面蘸取少量涂板或进行液体培养即可。也可以融解后使用，但随着冻融次数的增加，细菌的活力会逐渐下降。

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