聚合酶链式反应（ PCR）技术循环检测方法

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术。其核心原理是模拟生物体内的DNA复制过程，通过特定的引物、DNA聚合酶和dNTPs（脱氧核糖核苷酸）来实现目标DNA序列的指数级扩增。

PCR技术的实现依赖于三个关键步骤的循环进行：

一、变性（Denaturation）：在高温（通常90-96℃）下，双链DNA模板中的氢键断裂，导致双链分开为两条单链。这是扩增过程中的第一步，也是将模板DNA变成单链状态的过程。

二、退火（Annealing）：温度降低（通常50-65℃）后，引物与单链DNA模板上互补的序列结合。引物是短的DNA序列，设计用于与目标DNA片段的两端特定区域互补，从而引导后续的合成过程

三、延伸（Extension）：在中温（通常72℃左右）下，Taq DNA聚合酶（一种耐热DNA聚合酶）作用于引物-模板复合物，沿着模板DNA合成新的互补链。这个过程中，dNTPs被聚合到引物的3'端，形成新的DNA链，直至达到模板的末端。

这三个步骤组成一个循环，每完成一个循环，目标DNA片段的数量理论上增加一倍。通过25-35个循环，可以将目标DNA序列扩增至数百万倍，从而达到可以检测的水平。

PCR技术的检测方法主要依赖于扩增产物的检测，传统的PCR通常通过琼脂糖凝胶电泳来检测产物。随着技术的发展，出现了实时荧光定量PCR（qPCR）和数字PCR（Digital PCR, dPCR）等更为先进的检测方法。

一、传统PCR检测：

琼脂糖凝胶电泳：扩增后的DNA片段通过电泳分离，根据其大小在凝胶上形成条带，通过观察条带的出现与否来判断扩增是否成功。

二、实时荧光定量PCR（qPCR）：

荧光染料法：使用SYBR Green I等染料，其能嵌入双链DNA中并在荧光下发光，随着PCR循环的进行，荧光信号逐渐增强，通过检测荧光强度来定量目标DNA。

探针法：采用TaqMan探针等荧光标记探针，探针与目标序列结合后被DNA聚合酶酶切，报告基团与淬灭基团分离，释放荧光信号，通过实时监测荧光信号的变化来定量目标DNA。

三、数字PCR（dPCR）：

油包水液滴式数字PCR（ddPCR）：将样本分成数万个独立的微滴（液滴），每个微滴中包含少量的DNA模板。通过PCR扩增后，检测每个微滴中的荧光信号，阳性信号表示微滴中含有目标DNA，阴性信号则表示没有。通过泊松分布计算，最终获得目标DNA的绝对定量结果。

数字PCR技术由于其不依赖标准曲线、操作简单、灵敏度高（±10% copies/μL）和适合低丰度目标检测等优势，已成为一种非常有潜力的核酸定量技术。与传统qPCR相比，它在低拷贝数目标检测、拷贝数变异分析、稀有突变检测等领域展现出有的优势。