Piezo1 调控的内皮 KDM5B 参与紊乱血流诱导的动脉粥样硬化斑块形成

Endothelial KDM5B Regulated by Piezo1 Contributes to Disturbed Flow Induced Atherosclerotic Plaque Formation

Keywords: atherosclerosis, disturbed flow, endothelial cells, KDM5B, Piezo1

血管系统的稳态对动脉粥样硬化等心血管疾病的发病至关重要，血管内皮作为心血管系统的单细胞内衬，直接接触循环血液并承受壁面剪切应力，通过响应病理生理刺激维持血管稳态。内皮细胞可感知机械刺激并通过信号转导影响细胞功能，其功能障碍会导致血管病变，而动脉粥样硬化更易发生在血流紊乱区域，因此了解紊乱血流对内皮功能和基因表达的影响，有助于阐明斑块形成机制。

表观遗传改变（包括 DNA 甲基化、组蛋白翻译后修饰和非编码 RNA 等）在动脉粥样硬化的发生发展中起关键作用。研究表明，剪切应力可通过 DNA 甲基化和组蛋白乙酰化等机制调节内皮基因表达，其中组蛋白甲基化修饰是重要的染色质修饰形式（如层流与 H3K27 甲基化减少相关，可增强内皮抗炎基因表达），但紊乱血流对内皮组蛋白去甲基化酶表达及组蛋白去甲基化的调控机制尚不明确，这可能是理解动脉粥样硬化的关键。 而KDM5B 作为组蛋白 H3K4me2/me3 去甲基化酶，参与胚胎发育、肿瘤发生等过程，可调节内皮细胞炎症和血管生成相关的长链非编码 RNA，并在心脏纤维化和巨噬细胞炎症反应中发挥作用。

鉴于此，苏州大学唐仲英医学研究院的研究团队在一项研究中旨在阐明d-flow 条件下调节内皮 KDM5B 表达的机制，并探讨 KDM5B 对小鼠动脉粥样硬化发展的作用，结果发现 d-flow 诱导的内皮 KDM5B 表达受 Piezo1 调节，KDM5B 可能通过调节内皮细胞炎症导致动脉粥样硬化。研究结果发表在Journal of cellular and molecular medicine期刊题为“Endothelial KDM5B Regulated by Piezo1 Contributes to Disturbed Flow Induced Atherosclerotic Plaque Formation”。

首先，为绘制响应致动脉粥样硬化紊乱血流（d-flow）刺激的内皮组蛋白去甲基化酶表达谱,对PCL 小鼠模型的 scRNA-seq 进行分析。发现血管内皮细胞存在异质性，非 PCL 颈动脉中主要为 EC1、EC2 和 EC3 亚群，而 PCL 手术组出现新亚群 EC4 和 EC5（图 1A）。其中组蛋白赖氨酸去甲基化酶 KDM5 家族成员 KDM5B 在 d-flow 刺激的 EC4 亚群中选择性上调，而在其他 EC 亚群中未见上调（图 1B ），该结果通过 Kdm5b mRNA 表达（图 1C）和 KDM5B 免疫染色（图 1D） 得以证实。同时，在 d-flow 和动脉粥样硬化斑块易发的主动脉弓区域，Kdm5b mRNA 水平较降主动脉显著上调（图 1E）。体外实验借助锥板装置对人脐静脉内皮细胞施加层流或振荡流刺激 24 小时后发现，振荡流刺激的细胞中 KDM5B 的 mRNA 和蛋白水平显著高于层流刺激的细胞（图1F,G）。

图 1 组蛋白去甲基化酶 KDM5B 在紊乱血流条件下的血管内皮细胞中表达。

然后，为探究紊乱血流如何诱导内皮 KDM5B 表达，筛选了 shKdm5b HUVEC 中差异表达的机械传感器，并分析了 PCL 术后左颈动脉（LCA）的 scRNA-seq 数据集。发现传感器 Piezo1 主要表达于与紊乱血流相关的 EC4 和 EC5 亚群（图 2A），且 PCL 术后左颈动脉及主动脉弓中的 Piezo1 mRNA 水平较血流保护区域显著上调（图 2B,C）。体外实验显示，与静态培养的 HUVEC 相比，层流和紊乱血流刺激均能上调 Piezo1 mRNA 表达及 Ca??内流（图 2D,E）。通过基因和药理学方法进一步研究发现，敲低 Piezo1 可降低颈动脉内皮 KDM5B 表达（图 2F,G），而 Piezo1 激动剂 Yoda1 处理 HUVEC 可增加 KDM5B 表达，该作用可被阻断肽 GsMTx4 抑制（图 2H,I），证实 Piezo1 在紊乱血流条件下可通过调控钙信号促进内皮 KDM5B 表达。

图 2 Piezo1 在紊乱血流条件下促进内皮 KDM5B 的表达。

接下来，为了探究 Piezo1 如何调节紊乱血流（d-flow）诱导的 KDM5B 表达，研究人员首先通过 scRNA-seq 分析筛选出 PCL 手术 7 天后颈动脉内皮细胞中响应机械刺激的关键基因。经 GO 分析发现 12 个基因在 “机械刺激响应” 类别中显著富集（图 3A ）。随后利用生物信息学工具预测 KDM5B 转录因子，发现 44 个预测因子中 ETS1 和 c-JUN 与机械刺激响应基因重叠（图 3B、C ）。进一步通过免疫染色实验证实，PCL 手术的左侧颈动脉内皮细胞中 ETS1 和磷酸化 c-JUN 水平高于未手术的右侧颈动脉（图 3D、E），且暴露于振荡切应力的人脐静脉内皮细胞中这两种分子的表达水平也显著高于层流切应力条件下的细胞（图 3F、G）。这些结果表明，Piezo1 可能通过 ETS1 和 c-JUN 介导，在紊乱血流条件下调控内皮细胞中 KDM5B 的表达。

为确定 Kdm5b 是否为 ETS1 和 c-JUN 的靶基因，利用荧光素酶报告基因实验在 HEK293T 细胞检测ETS1 和 c-JUN 与 Kdm5b 启动子区域的结合情况。结果显示，转染 ETS1 或 c-JUN 质粒后，含 Kdm5b 启动子区域的报告基因荧光素酶活性高于转染载体对照的情况（图 3H,I）表明 Kdm5b 是二者的靶基因。随后，测定了 Piezo1 信号对内皮细胞中 ETS1 表达和 c-JUN 激活的影响。结果显示， 通过 Yoda1 激活 Piezo1 后，内皮细胞中 ETS1 表达上调且 c-JUN 发生磷酸化，而 Piezo1 抑制剂 GsMTx4 可逆转这一效应（图 3J,K）。使用 ETS1 抑制剂 TK216 或 c-JUN 抑制剂 SP600125，可显著降低 Yoda1 诱导的 KDM5B 表达（图 3L）。综上表明，Piezo1 激活后通过诱导 ETS1 和 c-JUN 与 Kdm5b 启动子区域结合，从而增强紊乱血流刺激的内皮细胞中 KDM5B 的表达。

图 3  Piezo1 通过 ETS1 和 c-JUN 上调 KDM5B 的表达。

鉴于 KDM5 亚家族成员作为 H3K4 去甲基化酶可催化 H3K4me3 去甲基化，检测 PCL 手术 7 天后颈动脉中 H3K4me3的 修饰情况，发现紊乱血流下内皮细胞 H3K4me3 水平降低（图 4A）。同时，主动脉弓内皮细胞的 H3K4me3 水平显著低于降主动脉（图 4B）。且体外实验中暴露于振荡切应力的人脐静脉内皮细胞 H3K4me3 水平也低于层流切应力条件下的细胞（图 4C）。这些结果表明，紊乱血流可诱导血管内皮细胞中 H3K4me3 去甲基化。

接下来，对 KDM5B 和 Piezo1 在紊乱血流诱导的内皮组蛋白 H3K4me3 去甲基化中的作用。进行了研究。通过药物抑制与基因敲低实验证实，Piezo1 抑制剂 GsMTx4 可减少 Yoda1 诱导的 H3K4me3 去甲基化（图 4D），Piezo1 敲低能保护小鼠颈动脉免受紊乱血流所致的 H3K4me3 去甲基化（图 4E）。利用慢病毒载体 shKdm5b 敲低 KDM5B 表达后，小鼠颈动脉在紊乱血流下的 H3K4me3 去甲基化被抑制（图 4F），且口服 KDM5B/C 特异性抑制剂 KDM5‐IN‐1 也可阻断内皮细胞中该去甲基化过程（图 4G）。综上表明，机械传感器 Piezo1 通过调控 KDM5B 表达，使 Piezo1‐KDM5B 轴参与介导紊乱血流诱导的内皮组蛋白 H3K4me3 去甲基化过程。

图4  Piezo1-KDM5B 轴参与紊乱血流诱导的内皮组蛋白 H3K4me3 去甲基化。

最后，为研究 KDM5B 在内皮细胞中的作用，通过转导表达人源 shKdm5b 的慢病毒载体，构建了 Kdm5b 敲低的HUVECs，并通过定量 PCR 和免疫印迹实验验证了结果（图 5A）。 差异表达基因的 KEGG 信号通路分析显示，在“脂质与动脉粥样硬化”“流体剪切应力与动脉粥样硬化” 和 “NF-κB 信号通路” 中显著富集（图 5B），这表明内皮细胞中的 KDM5B 参与了动脉粥样硬化的发展。 KDM5B 敲低可显著抑制 NF-κB 信号通路相关的促炎基因（如 VCAM-1、ICAM-1）表达（图 5C-F），减少 TNF-α 诱导的 THP-1 细胞与内皮细胞的黏附（图 5G），进而抑制内皮炎症反应。这些结果表明，KDM5B 可能通过影响内皮炎症参与动脉粥样硬化的发生发展。

为了进一步验证了内皮 KDM5B 在紊乱血流诱导的动脉粥样硬化斑块形成中的作用，通过动物模型实验进行研究。在 ApoE?/?小鼠中，敲低颈动脉 Kdm5b 基因可使动脉粥样硬化斑块面积减少 41.45%，表明 KDM5B 缺失能抑制紊乱血流诱导的斑块形成。而在内皮细胞特异性敲除 KDM5B 的 Kdm5b f/f Cdh5 cre 小鼠中，动脉粥样硬化病变大小较对照组减少 57.76%（图 5H） ，直接证实内皮 KDM5B 促进斑块形成。值得注意的是，血清脂质水平和体重检测显示，KDM5B 缺失并未通过调节脂质代谢或体重影响动脉粥样硬化进程。该研究结果排除了脂质代谢因素的干扰，明确了内皮 KDM5B 通过非脂质依赖途径促进动脉粥样硬化斑块形成的机制，为靶向 KDM5B 防治动脉粥样硬化提供了更直接的实验依据。

图5  KDM5B 基因敲低可抑制内皮炎症并减小小鼠中紊乱血流诱导的颈动脉粥样硬化斑块大小。

总之，Piezo1 作为血流机械信号的感受器，在紊乱血流刺激下通过 ETS1 和 c-JUN 转录因子上调内皮细胞中 KDM5B 的表达，进而增加组蛋白 H3K4me3 水平，促进内皮炎症反应。从功能上讲，KDM5B 的缺失减少了内皮炎症，并减轻了紊乱血流诱导的颈动脉粥样硬化斑块的形成。

参考文献：Wu L, Jiang S, Zhou X, Li W, Ke J, Liu Z, Ren L, Lu Q, Li F, Tang C, Zhu L. Endothelial KDM5B Regulated by Piezo1 Contributes to Disturbed Flow Induced Atherosclerotic Plaque Formation. J Cell Mol Med. 2024 Dec;28(23):e70237. doi: 10.1111/jcmm.70237. PMID: 39643939; PMCID: PMC11624123.

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