组织单细胞悬液制备的标准流程及注意事项有哪些？

百欧博伟生物：制备高质量的单细胞悬液是许多实验（如流式细胞术、单细胞测序、原代细胞培养等）的关键步骤。以下是组织单细胞悬液制备的标准流程及注意事项：

一、实验前准备

1、仪器与耗材

无菌手术器械（剪刀、镊子、刀片等）

细胞筛（70 μm、40 μm尼龙滤网）

离心管、培养皿、移液器

恒温摇床或水浴锅（37℃）

离心机

2、试剂

磷酸盐缓冲液（PBS，含抗生素如青霉素/链霉素）

组织消化酶（根据组织类型选择）：

胶原酶（Collagenase I/IV，适用于结缔组织）

胰酶（Trypsin，适用于上皮组织）

透明质酸酶（Hyaluronidase，辅助消化细胞外基质）

DNA酶（DNase I，防止DNA导致细胞粘连）

终止液（含血清的培养基或含EDTA的缓冲液）

台盼蓝（检测细胞活性）

3、组织处理原则

保持低温操作（冰上处理，减少细胞死亡）。

快速处理新鲜组织（离体后尽快操作）。

二、标准制备流程

1、组织取材与清洗

将组织置于预冷的PBS中，去除脂肪、血管等非目标组织。

用PBS清洗3次，去除血液和杂质。

2、组织剪碎

将组织转移至培养皿中，用无菌剪刀剪成1-3 mm?的小块。

加入少量PBS保持湿润。

3、酶消化

根据组织类型选择消化液（示例）：

实体瘤/坚硬组织：胶原酶IV（1-2 mg/mL）+ DNase I（20 μg/mL）

脾/淋巴结：胶原酶D + 透明质酸酶

上皮组织：胰酶-EDTA

将组织块浸泡在消化液中，37℃振荡消化（15-60分钟，具体时间需预实验优化）。

每隔10分钟轻柔吹打一次，加速解离。

4、终止消化

加入含血清的培养基或EDTA缓冲液终止反应（血清抑制胰酶活性）。

用移液器反复吹打组织悬液，直至无明显大块组织。

5、过滤与离心

将悬液通过70 μm细胞筛过滤，去除未消化的组织块。

收集滤液，300-400 ×g 离心5分钟，弃上清。

用PBS重悬细胞，再次通过40 μm滤网（进一步提高单细胞率）。

6、细胞清洗与重悬

用PBS或培养基洗涤细胞2次，离心去除残留酶和碎片。

重悬于适量缓冲液中（如PBS + 0.04% BSA）。

7、细胞计数与活性检测

台盼蓝染色法：活细胞率需 >85%（若活性低，可优化消化时间或酶浓度）。

调整细胞浓度至目标值（如1×10? cells/mL）。

三、不同组织类型的注意事项

1、实体瘤

可能需要机械辅助（如用注射器反复吹打或轻柔研磨）。

使用复合酶（如胶原酶 + 分散酶 Dispase）。

2、脾脏/淋巴结

可直接机械研磨（用注射器活塞压碎），无需长时间酶消化。

3、肝脏/肾脏

胶原酶消化后需多次洗涤去除肝细胞碎片。

4、脑组织

使用低浓度胰酶（0.25%）+ DNase，避免过度消化神经元。

四、常见问题与解决方案

五、质量控制

显微镜观察：确认细胞为单个分散，无明显团块或碎片。

流式细胞术检测：通过前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）评估细胞均一性。

功能性验证：根据后续实验（如细胞培养、染色）结果反向优化流程。

通过以上步骤，可高效制备高质量单细胞悬液，为下游实验奠定基础。不同组织需灵活调整方案，建议通过预实验确定条件。

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