Kirkstall QV 3D 仿生肠道绒毛模型在肠道感染建模与抗菌药物筛选中的应用

通过结构仿生与功能整合，不仅为肠道感染机制研究提供了动态平台，还为抗菌药物（尤其是噬菌体疗法）的高通量筛选开辟了新路径，其核心优势在于三维结构诱导的组织功能化与快速生理响应能力，显著提升了体外模型与体内环境的一致性。

一、肠道感染建模实验步骤

1. 模型准备与细菌培养

- 组织模型构建：将Caco-2与HT29-MTX-E12细胞按6:1比例接种于V-ECM（绒毛-隐窝仿生界面）、F-ECM（平坦ECM界面），培养72小时形成完整上皮层。

- 细菌制备：使用大肠杆菌（E. coli）菌株（如ATCC BAA-2326™或ATCC 11303™），接种于LB琼脂板37℃培养24小时，收集菌落并调整菌液浓度至OD???=0.01或0.1。

2. 感染模型建立与动态监测

- 感染接种：移除模型培养基，加入含大肠杆菌的培养基，共培养72小时，每24小时通过荧光显微镜观察细菌与组织的互作（细菌用GFP标记，细胞用CM-Dil染色）。

- 覆盖面积分析：利用ImageJ软件量化GFP标记细菌在组织表面的覆盖比例，对比V-ECM与对照组的差异。

- 屏障功能评估：通过电化学阻抗谱（EIS）测量跨上皮电阻（TEER），感染后TEER值的变化反映组织屏障完整性。V-ECM组在感染后TEER反而升高，而F-ECM组显著下降。

3. 细菌定植与侵袭能力检测

- 菌落计数（CFU）：收集培养介质（浮游菌）和刮取组织表面（黏附菌），梯度稀释后接种于LB平板，计算CFU/mL。V-ECM组黏附菌数量显著低于对照组。

- 侵袭实验：采用庆大霉素保护法，感染后用庆大霉素杀死胞外菌，裂解细胞后培养计数，评估细菌侵袭组织的能力。V-ECM组侵袭菌比例仅为0.1%，远低于F-ECM的3.7%。

4. 抗菌机制验证

- 抗菌肽（AMPs）检测：通过ELISA测定感染后组织分泌的人β-防御素2（HBD2），V-ECM组感染后HBD2分泌量显著升高。

- 基因表达分析：RT-PCR检测AMPs相关基因（如DEFB4A、DEFB103B）及炎症因子（IL-1α、TNF），V-ECM组AMPs基因上调，而对照组促炎基因激活。

- 黏膜屏障观察：Alcian Blue染色显示V-ECM组黏膜层覆盖面积达81.28%，而F-ECM组仅11.32%，黏液层的完整性抑制了细菌黏附。

二、抗菌药物筛选实验步骤

1. 耐药菌感染模型构建

- 耐药菌制备：将大肠杆菌转化为卡那霉素（Kan）耐药株（如携带mini-Tn7-kan-gfp质粒），调整OD???=0.1用于感染。

- 感染预处理：V-ECM模型培养72小时后，接种耐药菌4小时，随后更换含药物的培养基。

2. 药物处理与效果对比

- 药物设置：实验组分为T4噬菌体组（10? PFU/mL）、Kan组（100 μg/mL）及对照组（无药）。

- 动态监测：每8小时取样，荧光显微镜观察细菌覆盖面积，CFU计数评估细菌数量变化。T4噬菌体组24小时内细菌覆盖从84%降至接近0，而Kan组无明显效果。

3. 噬菌体增殖与抗菌机制分析

- 噬菌斑检测：收集T4噬菌体处理后的培养基，梯度稀释后接种于双层琼脂，观察噬菌斑形成。24小时后噬菌斑数量增加约100倍，表明噬菌体在感染部位增殖。

- 电镜观察：透射电镜（TEM）显示T4噬菌体吸附于细菌表面并导致菌体裂解，而Kan处理组细菌膜结构完整。

- 多重感染指数（MOI）：计算噬菌体与细菌的比例，T4组MOI在24小时内从1:1升至10?:1，形成“自扩增”抗菌效应。

三、关键技术优势与实验验证

1. 模型性能对比

2. 创新点与应用价值

- 快速筛选平台：24小时内完成抗菌效果评估，较传统方法（需数周）大幅缩短周期。

- 仿生机制模拟：绒毛-隐窝结构促进黏液层与AMP协同作用，更贴近体内抗菌机制。

- 耐药菌治疗潜力：噬菌体在V-ECM模型中可自我扩增，为AMR（抗微生物药物耐药性）感染提供新策略。

作者将 3D 仿生肠道绒毛模型应用于肠道感染建模和抗菌药物筛选。研究人员以大肠杆菌（E. coli）为模型病原体，比较了该模型与传统 2D 培养模型在感染过程中的差异。

实验结果显示，在仿生界面上培养的类器官能够有效抵抗大肠杆菌的感染。与对照组相比，其表面的细菌定植和生物膜形成明显减少，这主要归因于类器官分泌的天然抗菌肽（AMPs）水平升高。进一步的机制研究表明，仿生界面的结构特征促进了杯状细胞的分化和黏蛋白的分泌，形成了有效的黏膜屏障，从而抑制了病原体的黏附和入侵。

基于该模型的良好性能，研究人员还进行了抗菌药物筛选实验。他们比较了传统抗生素卡那霉素和噬菌体 T4 对耐药大肠杆菌的治疗效果。结果显示，噬菌体 T4 能够在 24 小时内显著降低细菌数量，而卡那霉素则由于细菌耐药性而效果不佳。这一结果不仅验证了该模型在抗菌药物筛选中的实用性，也为耐药菌感染的治疗提供了新的思路。

四、实验拓展与未来方向

- 微流控整合：将V-ECM模型接入英国Kirkstall Quasi Vivo器官芯片（OoC），模拟肠道蠕动流场，评估动态剪切力对感染与药物效果的影响。

- 共培养系统：构建英国Kirkstall Quasi Vivo双腔器官芯片（OoC），上层肠道组织+下层血管内皮细胞，研究病原体跨屏障侵袭与免疫细胞互作。

- 原代类器官验证：使用患者来源的肠道类器官（hIOs）接种于V-ECM，提升模型临床转化价值。

附：超47亿元！国家科技重大专项2025年项目申报指南发布（以下摘自2025.6.30“科奖中心”）

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