聚合酶链式反应（PCR）关键要素详解

 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应是一个强大的分子生物学技术，用于扩增特定的DNA片段。PCR反应指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，体系中加入dNTP、Mg2+以及延伸因子、扩增增强因子，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。PCR反应将微量目的DNA片段扩增一百万以上，它以敏感度高，特异强，产率高，重复好，以快速简便优点迅速成分子生物学研究中最为广泛的方法。

PCR反应的成功依赖于五个关键要素：

1. 引物：

1) 引物是一段短的DNA序列，用于与目标DNA模板的特定区域配对。

2) 设计原则包括长度（1530 bp）、G+C含量（40%60%）、避免二级结构和引物间互补等。

3) 通常每条引物的浓度为0.10.5 μmol/L，过高可能导致非特异性扩增。

2. 模板DNA：

    是待扩增的DNA序列，可以是基因组DNA、cDNA或质粒DNA。

    数量和纯度对结果至关重要，通常使用102105拷贝，但过量可能增加非特异性产物。

    单链和双链DNA均可作为模板，但线性DNA比环状DNA扩增效果更好。

3. DNA聚合酶：

1) 负责催化DNA合成，常用的是Taq DNA聚合酶，因其耐高温特性。

2) 其他如Pfu、Phusion等酶具有更高保真度，适用于特定应用。

3) 酶的浓度通常为1.02.5 U/100 μL反应液，过高或过低均影响扩增效率。

4. dNTPs（脱氧核苷三磷酸）：

1) 作为DNA合成的原料，通常等量加入反应体系，终浓度为20200 μmol/L。

2) 浓度过高可能抑制Taq酶活性，影响产物特异性。

5. Mg2+：

1) 作为DNA聚合酶的辅助因子，影响酶活性和产物特异性。

2) 终浓度通常为0.52.5 mmol/L，需要根据引物Tm值和dNTP浓度调整。

此外，PCR反应还需要缓冲液提供适宜的pH和离子环境，以及适当的温度控制（变性、退火、延伸三个阶段）来完成循环扩增。