T0214 2xTaq ultra PCR Mix 蓝色（含染料）

2xTaq ultra PCR Mix 蓝色（含染料）

产品货号：T0214

存储条件：-20℃

2xTaq ultra PCR Mix 蓝色（含染料）

产品说明

2x Taq Ultra PCR mix 的浓度为 2x，使用方便快捷，能减少 PCR操作过程中的污染，使用时只需取适量2x Taq Ultra PCR mix(蓝色染料)，加入模板和引物，并加入ddH2O 补足体积，使反应体系浓度为 1x，即可进行 PCR 反应。PCR 产物 3'端带突出A碱基，纯化后可直接用于 T/A 克隆。

本产品中含有 Taq DNA 聚合酶和一种含有 3'→5'外切活性的蛋白，能够高效扩增≤7 kb 的 DNA 片段，扩增产量高，配合优化后的反应缓冲液，可实现对不同 GC 含量(30%~70%)的高效扩增。此外相较于普通Taq PCR Mix 延伸速度提高了 2~4 倍，可有效缩短反应时间。

本PCR Mix中包含两种染料，PCR产物无需添加 Loading Buffer可直接点样电泳，且电泳过程中会出现蓝色和红色两个指示条带。该染料不影响 PCR 扩增效率，但对于需要对PCR 产物进行吸光度、荧光等光学分析的实验，建议在分析前对 PCR产物进行纯化。

质量控制

核酸内切酶活性检测

将25 μl 2x Taq ultra PCR Mix与 200 ng 超螺旋质粒 DNA 配制成 50 μl 反应体系，在37°C下，共同温育4h后，使用琼脂糖凝胶电泳检测，少于 10% 的质粒 DNA 转变成缺刻或线性状态。

非特异性核酸酶活性检测

将25 μl 2x Taq Ultra PCR Mix与 15 ng 双链 DNA 片段配制成 50 μl反应体系，在 37℃下温育 16 h，使用琼脂糖凝胶电泳检测双链 DNA 底物无变化。

使用方法

1.常规 PCR 反应体系 ( 冰上操作 )

a. 需融解完quan后使用，防止离子浓度不均匀；

b. 引物推荐终浓度为0.2~0.4 μM，效果不佳时可以在 0.1~1 μM 浓度范围内进行调整；

c. 不同模板最佳反应浓度有所不同，以 50 μl 体系为例：模板为基因组 DNA 时一般推荐的使用量为 10~200 ng；当模板为质粒或病毒 DNA 时，一般推荐的使用量为 10 pg~5 ng。模板量过多时容易造成非特异性扩增。

2. 三步法 PCR 反应程序

3. 二步法 PCR 反应程序

d. 菌落 PCR 时预变性 10 min，可充分破壁细胞，大肠杆菌或酵母菌均可高效扩增。

e. 退火温度请根据引物 Tm 值设置。如果需要，推荐通过建立温度梯度寻找引物与模板结合的最适温度。此外，退火温度直接决定扩增特异性，如发现扩增特异性差，可适当提高退火温度。

f. 目的片段长度< 3 kb，延伸时间可缩短至 15 s/kb；目的片段长度>3 kb，延伸时间建议 30 s/kb。若要达到最佳扩增效果或较高产量，推荐统一使用 30s/kb 速度延伸。 

注意事项

一、引物设计

1. 引物 3' 端最后一个碱基最好为 G 或者 C。

2. 引物 3' 端最后8个碱基应避免出现连续错配，同时也避免出现发夹结构。

3. 正向引物和反向引物的 Tm 值相差不超过 1℃为佳，Tm值调整至 55~65°C为佳(引物Tm值推荐使用 Primer Premier5进行计算)。

4. 引物额外附加序列，即与模板非配对序列，不应参与引物 Tm 值计算；引物的 GC 含量控制在 40%~60% 之间。

5. 引物 A、G、C、T整体分布要尽量均匀，避免使用 GC 或者 AT 含量高的区域。

6. 引物内部或者两条引物之间避免有5个碱基以上的互补序列，两条引物的 3'端避免有3个碱基以上的互补序列。

7. 引物设计完毕请使用 NCBI BLAST 功能检索引物特异性，以避免产生非特异性扩增。

二. 产物电泳与染色

建议使用泡染法进行电泳后染色，胶染法会导致红色指示条带发生弥散，不利于条带指示，对蓝色指示条带无影响。蓝色条带在 1% TAE 缓冲液中迁移速率约等于 1500 bp，红色条带在 1% TAE 缓冲液中迁移速率约等于 100 bp。